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    ELISA測(cè)定植物組織中游離氨基酸總量

    發(fā)布時(shí)間: 2016-08-30  點(diǎn)擊次數(shù): 1495次

    游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物,其顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比。
    分光光度計(jì);電子天平;容量瓶25ml或50ml 3個(gè);漏斗(直徑6厘米)3個(gè)、濾紙適量;20ml刻度試管 7支;移液管0.5ml 3支、5ml 1支;試管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜(封試管口);吸水紙;擦鏡紙適量;電爐;水浴鍋(含鐵絲筐)。
    1.3%茚三酮試劑 稱3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里,貯于棕色瓶中。此試劑應(yīng)放在冷涼處,不宜久放,使用期約10天。
    2.氰酸鹽緩沖液(按以下方法配制):
    (1)NaCN貯備液0.01mol/L(490mg/L)。
    (2)醋酸緩沖液:稱360g醋酸鈉(含三分子結(jié)晶水)溶于約300ml無(wú)氨蒸餾水中,加66.67ml冰醋酸再用無(wú)氨蒸餾水稀釋至1L。
    取溶液(1)20ml,用溶液(2)定容到1L。
    3.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 稱取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg(或α-丙氨酸8.9mg)溶于10%的異丙醇中,并在100ml容量瓶中用10%異丙醇稀釋至刻度,混勻,即為1mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸貯備液,置冰箱中保存。為了制備工作液,可取貯備液與等量無(wú)氨蒸餾水混合,此液濃度為0.5mmol/L,即1ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg。
    4.95%乙醇;5.異丙醇(分析純)。
    1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取20ml刻度試管18支,按下表15-1加入各試劑。加完試劑后混勻,在100℃水浴中加熱12min(加熱時(shí)封口),取出在冷水中迅速冷卻,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛搖試管,使加熱時(shí)形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色,此時(shí)溶液呈藍(lán)紫色。于570nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度(以空白管為參比),以氨基酸濃度為橫坐標(biāo),光密度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出直線方程。
    2.樣品提取 選取有代表性的植物葉片(或其它組織),洗凈擦干,剪碎混勻,迅速稱取0.10~0.20g(視氨基酸含量多少而定),共稱3份,分別加入20ml刻度試管中,再加蒸餾水10ml蓋塞(或系上塑料薄膜),置沸水浴中20min以提取游離氨基酸,到時(shí)取出在自來(lái)水中冷卻,把上清液濾入25ml容量瓶中,之后再往試管中加5ml蒸餾水,置沸水浴上再加熱10min,過(guò)濾并反復(fù)沖洗殘?jiān)?,zui后定容至刻度,搖勻。
    3.樣品測(cè)定 另取4支潔凈干燥的試管,其中3支分別加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸餾水,然后在上述4支試管中分別加入NaCN緩沖液、水合茚三酮各0.5ml,加完試劑后蓋塞,置沸水浴上加熱12min,冷卻后,再分別加5ml 95%乙醇,搖勻,以空白作參比,在波長(zhǎng)570nm下測(cè)其光密度。

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